乳腺生物反应器

生物反应器的乳腺生物

将所需目的基因构建入载体，加上适当的调控序列，转入动物胚胎细胞，使转基因动物分泌的乳汁中含有所需要药用蛋白。从融合基因转入胚胎细胞到收集蛋白质有一个过程，包括胚胎植入、分娩和转基因动物的生长。转基因动物从出生到第一次泌乳，猪、羊、牛各需12、14、16个月；并且只有雌性动物泌乳且不连续，一般可持续2、6、10个月。牛、羊等大型家畜能对药用蛋白进行正确的后加工，使之具有较高的生物活性，同时产奶量大，易于大规模生产，因而成为乳腺生物反应器理想的动物类型。抗凝血酶Ⅲ第一个进入临床试验的转基因蛋白产物是抗凝血酶Ⅲ，将半乳糖β-酪蛋白的启动子和含抗凝血酶Ⅲ基因序列相连，转入绵羊胚胎细胞，在转基因绵羊的乳液中得到有生物活性的蛋白产量可达7g/L[2]。目前该蛋白正用于冠状动脉旁路手术患者的二期临床验证。β-乳球蛋白在实验过程中人们发现牛的β-乳球蛋白（BLG）基因非常稳定，并能在乳腺中特异性表达。Hyttinen等[3]将含有5'端2.8kb和3'端1.9kb的牛BLG基因片段构建成载体，转入小鼠胚胎细胞，可在转基因小鼠的乳腺中特异表达高水平的BLG，此外，还发现CpG位点的甲基化程度与BLG的表达量有关，甲基化少的转基因小鼠乳液中BLG分泌量较大，可达1～2mg/ml，而其他转基因小鼠分泌量小于0.1mg/ml。红细胞生成素（EPO） 目前国内外均采用CHO细胞表达生产人EPO，成本比较昂贵，而用转基因动物生产的EPO，可能是一条理想的途径。将EPO dNA分别以HindⅢ和BamHI酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收5.4kb的HinⅢ/BamHI片段，插入pGEM-7zf(+）载体，再将867bp的BLG启动子插入EPO基因之前EcoR、ClaI位点，构建表达载体pGEM-3zf(+）β-LG-EPO。通过显微注射方法得到转基因小鼠乳汗中的EPO含量可达0.5μg/ml[4]。α1-抗胰蛋白酶这也是一个利用BLG基因构建的重组蛋白。将BLG5'末端4.0kb序列与人的α1-抗胰蛋白酶（α1AT）基因的6.5kb片段（去掉第一个内含子）融合，再连接羊的BLG启动子，以pPOLYⅢ-Ⅰ为载体，转入羊的胚胎细胞，可在转基因羊分泌的乳液中得到含量高达60.0mg/ml的重组蛋白α1AT[5]。转基因在两年前进入了临床验证。因子ⅨSchnieke等[6]将羊的BLG基因5'末端和人的因子Ⅸ cDNA 与含有BLG复制单元和3'末端的片段融合，将构建的杂合基因转入羊的胚胎细胞，从分泌的乳汁中得到125μg/ml的重组蛋白。黄淑帧教授等[7]构建了一个含有小鼠MAR元件、牛β-酪蛋白基因调控序列和hFⅨ微基因的hFⅨ乳腺组织特异性表达载体pMCⅨm，其中hF Ⅸ微基因包括全长hF Ⅸ cDNA ，800bp经过改造的内含子1序列和hFⅨ蛋白的信号肽序列。将线形化的表达载体pMC Ⅸm导入羊的受精卵。转基因羊分泌的乳汁中hFⅨ蛋白的含量约为95ng/ml。在另一实验中，Yull等[8]将BLG5'末端序列，fⅨ编码序列和缺失隐性3'端连接点的f Ⅸ3'末端不翻译区域的一个小片段融合，构成杂合基因，去掉SphI和SmaI位点，克隆入移去了pBJ41的SphI/EcoRV。转入小鼠胚胎细胞，得到的重组蛋白产量达0.06mg/ml。经过进一步研究，发现是转基因动物乳腺中对DNA的错误剪切使分泌量降低，从而增高重组蛋白产率。在乳腺组织中表达有完全活性的因子Ⅸ是比较成功的，尤其是乳腺组织对因子Ⅸ N端附近的一段含12个葡萄糖残基的序列进行γ-羧化以保持其活性，而在以前的天然蛋白中没有发现γ-羧化作用。因子Ⅷ人FⅧcDNA长约7.2kb，是目前为止表达的最长cDNA。将它插入小鼠的乳清酸性蛋白（WAP）基因中启动子（2.5kb）的下游，使之在乳腺中靶向分泌FⅧ重组蛋白。在WAP/FⅧcDNA构建的转基因小鼠中rFⅧ表达最低，而在转基因猪中可达1.0～2.7μg/ml[9]。单克降抗体Castilla等[10]将编码了重组单克降抗体（rMab）6A.C3的免疫球蛋白基因cDNA插入小鼠WAP dNA基因组的第一个外显子，使rMab 6A.C3的表达可以由WAP基因调控序列来控制，将构建的杂合基因注入小鼠胚胎细胞原核，使小鼠乳腺分泌有活性的单克降抗体，这种转基因表达产物将广泛应用于预防新生儿肠道感染。C蛋白同样在WAP基因的第一个外显子位点，Drews等[11]将人C蛋白cDNA插入，转入小鼠胚胎细胞，可得到产量达1.6mg/ml的重组蛋白。而将上述杂合基因转入猪的胚胎细胞，可使猪分泌出380μg/mlμg/ml·hr的外源蛋白，活性与人血浆中C蛋白的活性相同。由于C蛋白的抗凝活性依赖于轻链膜结合区域正确的γ-羧化，因此，转基因猪能分泌有活性的C蛋白表明猪的乳腺细胞可对C蛋白前体高速率地进行γ-羧化，以使成熟C蛋白有完整的活性。

科学家研究的乳房生物反应器,改造的是（ ） A、动物的乳房 B、动物的食物 C、动物的基因 D、动物个体的大

资料分析
1.利用生物反应器生产人类所需的物质，具有生产成本低，效率高，设备简单，产品作用效果显著(或活性高)，减少工业污染等优点。如转基因动物的乳汁能够治疗相应的人类疾病。
2.不是。利用生物反应器还能生产人类所需的营养品如无乳糖奶、含有人的转铁蛋白的牛奶、人牛混合奶等。科学家还利用蚯蚓生物反应器处理有机废物，生产营养价值较高的生物肥料等。
技能训练
长颈鹿与宇航员失重现象
长颈鹿之所以能将血液通过长长的颈输送到头部，是由于长颈鹿的血压很高。据测定，长颈鹿的血压比人的正常血压高出2倍。这样高的血压为什么不会使长颈鹿患脑溢血而死亡呢？这与长颈鹿身体的结构有关。首先，长颈鹿血管周围的肌肉非常发达，能压缩血管，控制血流量；同时长颈鹿腿部及全身的皮肤和筋膜绷得很紧，利于下肢的血液向上回流。科学家由此受到启示，在训练宇航员对，设置一种特殊器械，让宇航员利用这种器械每天锻炼几小时，以防止宇航员血管周围肌肉退化；在宇宙飞船升空时，科学家根据长颈鹿利用紧绷的皮肤可控制血管压力的原理，研制了飞行服——“抗荷服”。抗荷服上安有充气装置，随着飞船速度的增高，抗荷服可以充入一定量的气体，从而对血管产生一定的压力，使宇航员的血压保持正常。同时，宇航员腹部以下部位是套入抽去空气的密封装置中的，这样可以减小宇航员腿部的血压，利于身体上部的血液向下肢输送。
蝙蝠的回声定位与雷达
蝙蝠在飞行时，不断从喉咙中发出超声波脉冲，声波碰到障碍物后被反射回来，蝙蝠再用耳朵接受回声，就可以判断前边物体的大小、方向和距离。科学家根据蝙蝠发出超声波探测目标的“回波原理”发明了雷达，用以及时探测飞机的方位和距离。
乌龟的龟壳与薄壳建筑
龟壳的背甲呈拱形，跨度大，包括许多力学原理。虽然它只有2 mm的厚度，但使用铁锤敲砸也很难破坏它。建筑学家模仿它进行了薄壳建筑设计。这类建筑有许多优点：用料少，跨度大，坚固耐用。薄壳建筑也并非都是拱形，举世闻名的悉尼歌剧院则像一组泊港的群帆。
萤火虫与冷光
萤火虫所发出的光是化学光，它通过一定反应将化学能几乎百分之百地转变成了光能。人们由此得到启发，模拟萤火虫发光原理制造了由电能转变为光能的荧光灯。但目前普通的荧光灯泡只能将所消耗的电能的6%～25%变成光能。如果萤火虫发光原理模拟得充分，荧光灯消耗的电能就会几乎百分之百地转换成光能，可以大量节约能源。
除了上述应用外，仿生还广泛地应用于以下几个方面。(1)生物体与人造器官，如模仿蛙眼的结构原理制造的电子蛙眼应用于雷达系统、机场和交通要道上，起监视、防止事故发生的作用。(2)模拟人的大脑，制造“人工智能”计算机，它是会看、会听、会说、会写的计算机。(3)制造仿生材料，用仿生材料作为涂层和包裹材料，它能提高人体对移植器官的接受能力；仿生材料还可用来代替受损伤的韧带和动脉血管等。
练习
1.进行仿生研究需要广泛的知识，如动物学、物理学、生理学、数学等方面的知识；同时还需要工程设计、制造和美工等技能。
2.传播疾病的动物有：蚊类可以传播脑炎、黄热病、疟疾和血丝虫病；带有绦虫幼虫和虫卵的猪可以传播猪肉绦虫病；苍蝇可以传播消化道传染病；带有狂犬病毒的狗可以传播狂犬病；虱可以传播斑疹伤寒等。
危害农作物的动物有：大多数鼠类由于有挖土掘洞的习性，可以破坏牧场；它们啃食农作物的根系，对农作物产生危害；菜粉蝶的幼虫——菜青虫以十字花科的植物为食，危害蔬菜生长；棉铃虫啃食棉的叶、花蕾和棉铃，危害棉的生长等。
3.提示：可从以下几方面选择撰写“动物在日常生活中的作用”调查报告。
(1)食用动物的营养价值。
(2)动物在娱乐和旅游中的作用。
(3)动物在医药保健中的作用。
(4)你在一天的生活中，与哪些动物有直接或间接的关系。
养殖专业户访谈录
（1）是如何走上养殖致富道路的。
（2）在养殖道路上历尽的艰辛，遇到的困难，以及是如何克服的。
（3）从中体味到的乐趣。
（4）下一步奋斗的目标。
（5）目前被困扰的问题。
（6）从走访中得到的启示。
四、背景资料
生物反应器
一般是把目的基因(外源基因)在血液循环系统或乳腺中表达的转基因动物叫生物反应器。而最为理想的生物反应器是乳房生物反应器。乳房生物反应器是用转基因动物的乳房代替生物发酵罐，源源不断地生产供人类治疗疾病和保健用的药用蛋白。
乳房生物反应器的原理是，应用重组DNA技术和转基因技术，将目的基因转移到尚未分化的动物胚胎细胞(或受精卵)中，经胚胎移植，得到能在乳腺中表达转基因产品的个体，其乳腺组织可分泌生产“目的产品”如具有药用价值的蛋白，这些蛋白进入奶中，再通过回收含转基因蛋白的动物奶，就可以提取有重要药用价值的生物活性蛋白。
利用转基因动物乳房生产药用蛋白的优点：(1)乳汁可以由乳腺不断地分泌，而且产量高，长期收集也不会对动物造成伤害；(2)由乳腺产生的药用蛋白只限制在乳腺内，最后分泌到乳汁中，一般不易对转基因动物的正常生理活动造成影响；(3)乳腺分泌的蛋白质是经过正常的高等哺乳动物对外源基因的转录和翻译后加工的，这使得生产的药物蛋白更接近于人类自身的蛋白质；(4)乳汁中的蛋白质种类较少，主要是酪蛋白、乳球蛋白、白蛋白和从血液中扩散而来的少量血清蛋白及免疫蛋白，因此从乳汁中提纯“目的蛋白”相对要容易些。
目前国外已有大量资金投向乳房生物反应器的研究和开发，使该项技术不断改进，竞争十分激烈。预计在21世纪，以乳房生物反应器为核心的新型产业将会迅速发展起来，在给企业带来巨大的经济效益的同时，也将造福于人类。
我国在“七五”计划中，就设立了“动物个体表达系统”的研究项目，其主要研究目标就是在动物乳腺中表达外源基因。科研工作者利用小鼠、兔、绵羊和山羊表达了十余种外源基因。1998年国家在“863”计划中，将“动物乳房反应器研究”作为重大项目，强化了该项研究的资助和管理工作。现在我国已有4种基因工程药物或疫苗在上海、长春、深圳等地生产并投放市场，另有十余种已进入中试阶段(表1)。